مرجع تخصصی آب و فاضلاب

از آنجا که باکتری های دیگری غیر از کلی فرم ها نیز قادر به تولید لاکتوز و تولید گاز می باشند ، بنابراین برای تشخیص قطعی کلی فرم ها لازم است سه دسته از آزمایشها ی زیر انجام شود :

1- آزمایش احتمالی

در این آزمایش از محیط کشت آبگوشت لاکتوز دار یا آبگوشت لوریل تریبتوز استفاده میشود .همانطور که از نام آزمایش حدس زده میشود ، این تست در صورت مثبت بودن فقط برای تشخیص احتمالی کلی فرمها انجام می گیرد ، زیرا ممکن است تعداد دیگری از باکتری ها غیر از کلی فرم ها نیز موجب تخمیر لاکتوز و تولید گاز در محیط کشت شوند .

روش آزمایش
 
برای آنجام آزمایش احتمالی به این ترتیب عمل می شود که سه لوله آزمایش انتخاب نموده و در هر کدام ده میلی لیتر از محیط کشت نامبرده می ریزیم ( محیط کشها باید توسط اتوکلاو استریل شده باشند ) سپس توسط پیپت استریل ده میلی لیتر از نمونه مورد آزمایش به هر کدام از لوله هل اضفه می کنیم .به همین ترتیب دوباره سه لوله دیگر انتخاب نموده و در آنها ده میلی لیتر محیط کشت افزوده و این بار به هر کدام از لوله ها  یک میلی لیتر نمونه اضفه می کنیم . همین کار را برای سه لوله دیگر تکرار نموده بااین تفاوت که در این سه لوله سو مبه هر کدام از لوله ها فقط 1/0 میلی لیتر از نمونه مورد آزمایش را می افزاییم . بنابر این در پایان  9 لوله خواهیم داشت که در هر کدام از آنها نیز یک لوله درهام برای مشاهده گاز تولید شده قرار می دهیم. آنگاه هر 9 لوله را به مدت 24+2 ساعت در انکباتور 35 c الی 37 c قرار میدهیم. بعد از گذشت مدت مذکور لوله ها را از نظر تولید گاز مورد لوله ها را مورد آزمایش قرار میدهیم . لوله هایی را که در آنها گاز تولید میشود به عنوان مثبت یاداشت میکنیم . برای جلوگیری از اشتباه واینکه آیا گازها در لوله های درهام تولید شده و یا اینکه حبابهای ریز هوا در آن بوجود آمده می توان با تلنگر زدن به دیواره لوله از نتیجه آزمایش اطمینان حاصل کرد . در صورتیکه همه لوله ها و یا بعضی از آنها منفی یعنی بدونه گاز هستند باید دوباره آنها را به مدت 24 ساعت دیگر در انکباتور قرار داده و پس از سپری شدن مدت مذکور لوله های با گاز را به عنوان مثبت یادداشت نمود .

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

1-برآورد با استفاده از توزیع آماری پوآسون

تو این روش نمونه آب و یا فاضلاب بایستی به دفعات مختلف رقیق شده تا شرایط برای برآورد دقیقتری از باکتریهای موجود در نمونه فراهم شود. در این روش بیشترین احتمال وجود یا عدم وجود باکتری در مجموعه ای از رقتهای ساخته شده از نمونه تعیین شده و عددی برآورد می شود که مربوط به نقطه ای از منحنی توزیع آماری پوآسون است که مقدار احتمال ماکزیمم می باشد.

2-برآورد با استفاده از روش توماس

در این روش نیز نمونه آب و یا فاضلاب بایستی به دفعات مختلف رقیق شده تا شرایط برای برآورد دقیقتری از باکتریهای موجود در نمونه فراهم شود. با در دست داشتن تعداد لوله هایی که در تست احتمالی مثبت  شده اند و همچنین مقدار میلیلیتر نمونه در لوله های منفی و مجموع لوله ها، مقدار MPN را برآورد میکند. تو این روش برای حالتی که تعداد لوله های منفی صفر باشه رابطه از نظر ریاضی تعریف نشده است.

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

یکی از روش های مرسوم و مورد اعتماد برای شمارش باکتری های کلی فرم در نمونه های آبی استفاده از روش تخمیر چندلوله ای یا اصطلاحاً روش MPN است.

در این آزمون برای شمارش کلی فرم ها از محیط کشتی استفاده می شود که محتوی قند لاکتوز باشد. معمولاً از محیط لاکتوز براث (lactose broth) و یا محیط لوریل تریپتوز براث (lauryl tryptose broth) برای این منظور استفاده می شود. پس از تهیه محیط کشت آن را به مقادیر مناسب در لوله هایی توزیع می کنند. سپس مقدار معینی از نمونه به هر لوله وارد می شود یا اصطلاحاً تلقیح می گردد. سپس لوله ها برای مدت 24 ساعت و حداکثر 48 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد قرار داده می شوند تا تخمیر لاکتوز در آن ها بررسی شود. برای بررسی تولید گاز در اثر تخمیر نیز قبل از استریل کردن لوله های محتوی محیط کشت در هر لوله یک لوله کوچک موسوم به لوله دورهام به صورت وارونه انداخته می شود. در صورتی که باکتری کلی فرم باشد از تخمیر لاکتوز گاز CO2 تولید می کند که مقداری از آن در لوله دورهام جمع می شود. البته می توان به جای بررسی تولید گاز به بررسی تولید اسید در لوله ها پرداخت. برای این منظور در زمان تهیه محیط کشت در آن مقداری معرف pH تحت عنوان bromocresol purple افزوده می شود. در اثر تولید اسید توسط باکتری در هر لوله محیط اسیدی می شود و رنگ معرف از ارغوانی به زرد تغییر می کند. تا اینجا مرحله احتمالی آزمون است. از آنجایی که در این مرحله علاوه بر کلی فرم ها باکتری های دیگری هم هستند که می توانند نتیجه ای مشابه کلی فرم ها بدهند در مرحله بعد لازم است حضور کلی فرم ها در هر یک از این لوله های مثبت تأیید شود. برای این منظور از هر یک از لوله هایی که از نظر حضور کلی فرم مثبت هستند (احتمالاً در آن ها کلی فرم رشد کرده) به لوله های محتوی محیط کشت انتخابی تری به نام برلیان گرین براث (brilliant green bile lactose broth یا BG broth) منتقل می کنند. این محیط کشت دارای ترکیباتی از قبیل نمک های صفراوی و برلیان گرین است که رشد باکتری های غیر کلی فرمی که ممکن است در مرحله احتمالی نتیجه مثبت در لوله های را سبب شده باشند داده باشند را متوقف می کنند. این لوله ها نیز به مدت ۲۴ ساعت و حداکثر ۴۸ ساعت در دمای 5/0±35 درجه قرار داده می شوند. رشد (کدورت) به همراه تولید گاز تأیید کننده حضور کلی فرم ها در لوله هایی است که از آن ها برای کشت در BG broth استفاده شده است (مرحله تأییدی). برای اطمینان از حضور کلی فرم ها در هر لوله از لوله های تأییدی و یا به عبارت دیگر انجام مرحله تکمیلی از هر یک از لوله های مثبت مرحله تأییدی با استفاده از لوپ سیمی روی محیط کشت جامد مک کانکی آگار یا محیط های مشابه از قبیل EMB agar کشت خطی داده می شود. پس از ۲۴ ساعت انکوبه گذرای در دمای 5/0±35 درجه سانتیگراد درصورتی که کلنی های کلی فرم ها که به رنگ قرمز تیره با یا بدون جلای فلزی و یا به رنگ صورتی هستند روی محیط دیده شوند به معنای اطمینان از حضور کلی فرم ها در لوله برلیان گرین که از آن انتقال انجام شده می باشد. کلنی های قرمز تیره را کلنی های تیپیک و کلنی های صورتی را کلنی های آتیپیک کلی فرم ها می خوانند. طبق دستورالعمل Standard Methods ویرایش ۲۱ (چاپ ۲۰۰۵) برای اطمینان از هر پلیت چند کلنی کلی فرم  انتخاب و  جهت رنگ آمیزی گرم روی اسلنت های نوترینت آگار کشت می شوند. همچنین از هر یک از این کلنی ها به محیط کشت مرحله احتمالی تلقیح می شود و ایجاد کدورت به همراه گاز یا اسید بررسی می شود.

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

MPN TEST
يكي از روشهاي ازمايش باكتريولوژي اب است .
Most Probable Number
محتملترين تعداد
 
1- مرحله احتمالی
 
1.این مرحله به گونه ای طراحی شده است که ضعیف ترین سلول کلی فرم نیز قادر به رشد باشد .
 
۲.این مرحله در محیط مکانکی برات یا لاکتوز برات که دارای لوله دورهام است انجام می شود. در هر دو محیط  قند لاکتوز وجود دارد عامل انتخابی برای باکتری های کلی فرم میباشد .
 
۳.کدورت محیط و وجود گاز نشان دهنده واکنش مثبت  و وجود باکتری های کلیفرم و احتمال الودگی مدفوعی است کدورت تنها وبدون تشکیل گاز به عنوان واکنش مثبت ارزیابی نمی شود زیرا در این صورت باکتری های رشد کرده اند که قادر به تولید گاز نبوده و کلی فرم محسوب نمی گردند.
 
 
روش كار در مرحله احتمالي :

 

•محيط كشت : لاكتوز براث دو غلظتي و تك غلظتي
•روش : مي تواند به روش 5لوله اي 9 لوله اي و 15 لوله اي باشد
•مقدار انتقال نمونه :10 و  1 و0.1سي سي مي باشد
•مدت زمان ماند : 24 تا 48 ساعت
•دما : 35 تا 37 درجه سانتيگراد در انكوباتور
•بيان نتيجه : در صورت پديد امدن گاز در دورهام و كدورت مثبت تلقي مي گردد

طريقه بيان نتايج :

 
•به دو روش مي باشد
1.از طريق جدول
2.از طريق فرمل توماس

 

2- ازمایش تاییدی
 
1.پس از واکنش مثبت ازمایش  احتمالی انجام می شود .
2.از محیط کشت BGLB استفاده می شود .
3.رنگ برلیانت گرین و اگزال موجود در این محیط کشت از رشد باکتری های غیر کلیفرمی ممانعت می کند .
4.وجود گاز در لوله دورهام نشان دهنده  واکنش مثبت ازمایش تاییدی است .

 

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

کلیفرم ها

گروهی از باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری ، گرم منفی ، میله ای شکل و بدون اسپور هستند که قادرند در شرایط هوازی در محیط های کشت انتخابی لاکتوزدار در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس در مدت 24 تا  48 ساعت تولید اسید و گاز کنند .

اساس روش

این روش  براساس تلقیح حجم معینی از نمونه آب به محیط انتخابی لاکتوز دار و گرمخانه گذاری در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس انجام می پذیرد . سپس با استفاده از محیط های کشت انتخابی و تائیدی ، وجود کلیفرم ها تائید می شود . 

نمونه برداری

دست کم 500 میلی لیتر آب را ( طبق استاندارد ملی 4208 ) سال 1376 آئین کار نمونه برداری از آب جهت آزمونهای باکتریولوژی نمونه برداری کنید .

مواد لازم

    محیط های کشت

آبگوشت P-A 1

 

ترکیبات           مقدار (غلضت معمولی )          مقدار (غلضت سه برابر )

عصاره گوشت گوساله            3 گرم                               9 گرم

پپتون                                  5 گرم                             15 گرم

لاکتوز                             46/7 گرم                        38/22 گرم

تریپتوز                              8/9 گرم                        49/ 29 گرم

دی پتاسیم هیدروژن فسفات 35/1 گرم                          05/4 گرم

منوپتاسیم هیدرژن فسفات   35/1 گرم                           05/4 گرم

کلرید سدیم                     46/2 گرم                         38/7 گرم

لوریل سولفات سدیم          05/0 گرم                         15/0 گرم

بروموکروزول ارغوانی          0085/0 گرم                      0255/0 گرم

آب مقطر                           1000 میلی لیتر                 1000 میلی لیتر

مرجع تخصصی آب و فاضلاب